Синтез вирусного белка осуществляется на рибосомах. Синтез вирусных компонентов
Есть данные, что в разных тканях или на разных поверхностях эпителиальных клеток механизмы адсорбции вирусов и их проникновения в клетку неодинаковы.
4. Синтез вирусных белков
В основе этого синтеза лежит тот же механизм, что и при синтезе белка в нормальных клетках. У РНК-содержащих пикорнавирусов функцию иРНК выполняют плюс-нити. У них односпиральная вирионная РНК транслируется с образованием одного гигантского полипептида, который затем расщепляется на отдельные функциональные белки. В синтезе полновирусного белка выражена постоянная во времени трансляция всех генов вирусной РНК. У орто-, рабдо- и парамиксовнрусов вирионная односпиральная РНК не транслируется, а транслируется комплементарная ей плюс-нить, поэтому синтез вирусных специфических белков начинается после образования вирусной иРНК (плюс-нити), которая комплементарна вирионной РНК-Минус-нити синтезируются на плюс-нити вирионной РНК-зависимой полимеразой (РНК-транскриптазой), находящейся в составе вириона в качестве структурного компонента. Синтезирующиеся вирионной полимеразой иРНК являются моноцистронными и значительно короче вирионной РНК. В процессе вирусной инфекции происходят распад клеточных полисом и образование вирусспецифических полисом.
Синтез вирусспецифического белка зависит от синтеза вирусной иРНК, но и влияет на него: если синтез белка нарушен, происходит затоваривание вновь образующейся иРНК в местах ее синтеза и тормозится дальнейший ее синтез.
Вирусные белки в процессе инфекции синтезируются в избыточном количестве, чем требуется для образования инфекционного вируса. Например, в клетках, инфицированных вирусами герпеса, в вирусное потомство включается только около 35% от общей массы вирусспецифических белков, синтезированных в клетках.
У большинства вирусов синтез белков осуществляется в цитоплазме; относительно ядерной локализации синтеза белков некоторых вирусов существует сомнение. Известно, что вирусные белки могут синтезироваться в одних структурах, а накапливаться- в других. Механизмы, ответственные за миграцию вирусных белков в ядро, не выяснены. Известно лишь, что отсутствие аргинина в среде приводит к подавлению миграции структурных белков вируса герпеса от места их синтеза (цитоплазмы) к месту сборки вирионов (ядру), хотя синтез ДНК и белка вируса не нарушен.
На разных стадиях инфекционного цикла могут преимущественно образовываться то одни, то другие группы вирусспецифических белков. Скорость их регулируется либо на уровне транскрипции (с образованием иРНК), либо на уровне трансляции (считывание иРНК на рибосомах).
В зараженной клетке непропорционально накапливаются иРНК с разных вирусных генов. Механизм этой непропорциональности заложен в самой вирусной частице. Этот же механизм определяет разную эффективность образования различ- ых белков. Стандартная вирусная частица содержит одну молекулу РНК и до 10 тыс. молекул белков. Помимо структур-ных белков, в зараженной клетке могут синтезироваться и не-структурные (но кодируемые вирусной РНК) белки. Наряду с синтезом белков в клетке при репродукции вируса гриппа происходит синтез и углеводных цепей, входящих в состав гликопротеидов. Присоединение углеводов осуществляется с помощью трансфераз, которые являются клеточными ферментами. Синтез липидов также осуществляется клеткой. Вирусная оболочка формируется при включении липидов из плазматической мембраны клетки-хозяина. Синтез вирусных нуклеиновых кислот и вирусспецифических белков происходит почти одновременно и не менее чем на 1 ч опережает созревание вирусных частиц.
5. Сборка вирионов и выход их из клетки
Синтез компонентов вирусных частиц в клетке разобщен и может протекать в разных структурах ядра и цитоплазмы. Вирусы, репликация которых проходит в ядрах, условно называют ядерными. В основном это ДНК-содержащие вирусы: адено-, папова-, парвовирусы, вирусы герпеса. Вирусы, реплицирующиеся в цитоплазме, называют цитоплазмэтическими. К ним относятся из ДНК-содержащих вирус оспы и большинство РНК-содержащих вирусов, за исключением ортомиксо- и ретровирусов. Однако это разделение весьма относительно, потому что в репродукции тех и других вирусов есть стадии, протекающие соответственно в цитоплазме и ядре.
Внутри ядра и цитоплазмы синтез вирусспецифических молекул также может быть разобщен. Так, например, синтез одних белков осуществляется на свободных полисомах, а других-на полисомах, связанных с мембранами. Вирусные нуклеиновые кислоты синтезируются в ассоциации с клеточными структурами вдали от полисом, которые синтезируют вирусные белки. При таком дизъюнктивном способе репродукции образование вирусной частицы возможно лишь в том случае, если вирусные нуклеиновые кислоты и белки обладают способностью при достаточной концентрации узнавать друг друга в многообразии клеточных белков и нуклеиновых кислот и самопроизвольно соединяться друг с другом, т. е. способны к самосборке.
В основе самосборки лежит специфическое белок-нуклеиновое и белок-белковое узнавание, которое может происходить в результате гидрофобных ионных и водородных связей, а также стерического соответствия. Белок-нуклеиновое узнавание ограничено небольшим участком молекулы нуклеиновой кислоты и определяется уникальными последовательностями нуклеотидов в некодирующей части вирусного генома. С этого узнавания участка генома вирусными капсидными белками начинается процесс сборки вирусной частицы. Присоединение остальных белковых молекул осуществляется за счет специфических белок-белковых взаимодействий или неспецифических белок-нуклеиновых взаимодействий.
Объединение белка с вирусными нуклеиновыми кислотами в клетке происходит спонтанно как чисто физико-химическая реакция агрегации, требующая участия дополнительных факторов (рН, ионной силы, ионов металлов, осмоса и т.п.). После того как концентрация вирусных РНК и белка достигает критического уровня; у сложно устроенных вирусов принципы самосборки обеспечивает от начала до конца морфогенез вирионов.
Для того чтобы представить этап созревания дочерних вирусных частиц у парамиксовирусов, необходимо выяснить, каким образом молекула 50S РНК, около 10 тыс. молекул белков, липидов и сахара собираются в зараженной клетке и образуют морфологически и биологически полноценную частицу. Созревание можно разделить на три этапа: 1) образование внутриклеточных нуклеокапсидов; 2) организация вирусной мембраны; 3) выход зрелой вирусной частицы из клетки с помощью так называемого почкования.
Образование нуклеокапсидов . Быстрое включение 50S РНК в капсид обусловлено сравнительно быстрым и в избытке накоплением в. зараженной клетке структурных белков нуклеокапсидов. Формирование (ассемблирование) вирионов происходит путем самосборки, которая обусловлена «узнаванием» РНК белками. Полагают, что узнающим белком является белок Р, поскольку он наиболее жестко связан с РНК в вирусных частицах. Считают, что узнаваемый участок РНК локализуется на 5"-конце молекулы. Нуклеокапсиды накапливаются в цитоплазме зараженных клеток, причем скорость образования внутриклеточных нуклеокапсидов гораздо выше, чем скорость образования вируса. Образование внутриклеточных нуклеокапсидов сопряжено во времени с биосинтезом 50S РНК.
Средний (латентный) период репродукции вирусов. В нем происходит синтез вирусных компонентов, НК и белка.
1) Транскрипция – переписывание информации с ДНК на РНК по законам генетического кода с помощью РНК-полимеразы. Вирусная НК вступает в контакт с рибосомами и налаживает синтез ранних белков. Репрессоры типа гистонов блокируют синтез клеточной ДНК. Гистон препятствует снятию информации с клеточной ДНК на иРНК. На рибосомы не поступает клеточная информация, они освобождаются от синтеза клеточных компонентов. Ранние белки влияют и на митотические функции клетки, и она прекращает деление. Некоторые вирусы налаживают синтез ферментов ДНКаз, которые разрушают клеточный геном, чтобы использовать продукты клеточного генома для синтеза вирусных НК. Наряду с подавлением синтеза клеточных компонентов НК вируса вызывает синтез белков-полимераз, необходимых для репликации вирусных НК.
2) Трансляция иРНК. Стратегия вирусного генома в отношении синтеза иРНК у разных вирусов разная. У ДНКовых вирусов: ДНК - транскрипция – РНК – трансляция – белок. Такая стратегия у герпесвирусов и аденовирусов. Геном вирусов, представленный + нитью РНК, имеет более простую форму. РНК + - белок. Пикорнавирусы, тогавирусы, коронавирусы. Вирусы, геном которых представлен РНК - : РНК - - иРНК – белок. При участии фермента транскриптазы происходит синтез иРНК. У ортомиксовирусов, парамиксовирусов, рабдовирусов. У ретровирусов передача генетической информации уникальная: РНК – ДНК – РНК – белок.
3) Репликация вирусных НК. Механизм репликации вирусных РНК и ДНК различен в зависимости от генома вируса. Субстратами для синтеза вирусных РНК и ДНК являются клеточные трифосфаты (АТФ, УТФ и т.д.) и углеводы (рибоза, дезоксирибоза). Разнообразие механизмов репликации связано с различными типами генома у вирусов.
· Если вирус содержит двунитчатую ДНК, то для её синтеза нужен фермент ДНК-полимераза. У многих вирусов этот фермент есть. Если этого фермента нет в составе вириона (герпес-, аденовирусы), происходит расхождение нитей, на одной из нитей синтезируется иРНК. Она идет на рибосомы, где синтезируется белок-фермент ДНК-полимераза. Он осуществляет сборку молекул точных копий вирусной ДНК из клеточных компонентов.
· Если в составе вириона имеется однонитчатая ДНК (парвовирусы), для её репликации необходим фермент ДНК-зависимая ДНК-полимераза, который входит в состав вириона. Этот фермент использует одну нить ДНК как матрицу, и на ней по принципу комплементарности строит вторую нить, т.е. на +нити сроится -нить, а на –нити - + нить. В дальнейшем на этой двуспиральной структуре синтезируются дочерние +нити ДНК. Матрицей является –нить ДНК.
· У РНКовых вирусов геном представлен +нитью РНК (пикорнавирусы). +нить идет на рибосомы и налаживает синтез белка РНК-полимеразы. Этот фермент строит комплементарную –нить РНК, а затем на ней, как на матрице, собираются +нити РНК.
· Если геном представлен –нитью РНК (рабдовирусы, ортомиксовирусы). –нить не вступает в контакт с рибосомами, не может наладить синтез белка. У этих вирусов должен быть фермент РНК-зависимая РНК-полимераза. Этот фермент синтезирует комплементарные +нити РНК, которые затем поступают в рибосомы клетки. Фермент РНК-полимераза синтезирует на +нити РНК многочисленные копии –нитей РНК.
· Если геном представлен несколькими фрагментами, то каждый фрагмент несет свою информацию на рибосомы (в виде +нити РНК).
· Вирусные двунитчатые РНК у реовирусов не могут поступать непосредственно в рибосомы. Передача генетической информации у них происходит через иРНК. В вирионах этих вирусов имеется фермент РНК-транскриптаза, с помощью которого синтезируется иРНК на матрице двунитчатой РНК. Фермент переписывает генетическую информацию с двунитчатой РНК на иРНК. иРНК поступает в рибосому, где вызывает синтез РНК-репликазы. Этот фермент синтезирует +нити РНК, комплементарные –нити, и вновь синтезируются двунитчатые молекулы РНК.
· У онкогенных вирусов геном представлен РНК. Геном этих вирусов должен войти в геном клетки. В составе вирионов этих вирусов имеется фермент РНК-зависимая ДНК-полимераза (обратная транскриптаза). Кроме того, у них есть фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза, осуществляющая синтез РНК на матрице ДНК.
Синтез вирусных НК идет до тех пор, пока есть строительный материал.
4) Синтез вирусных белков. АК состав вирусных белков не отличается в качественном отношении от АК состава клеточных белков. Те и другие построены из 20 АК. Синтез вирусных белков подчиняется всем закономерностям, которые присущи синтезу белков клетки, в его основе лежит тот же механизм. Белки синтезируются из АК клетки.
У ДНКовых вирусов процесс начинается с транскрипции, т.е. переписывания кода синтеза на матрицы ДНК. По принципу комплементарности образуются поздние иРНК. В их синтезе участвует ДНК-зависимая РНК-полимераза. Далее идет процесс трансляции, т.е. перевод генетической информации, содержащейся в иРНК на специфическую последовательность АК в синтезируемых вирусоспецифических белках. Считывание информации и синтез белка осуществляется с помощью транспортных РНК, которые в соответствии с кодом, т.е. чередованием пуриновых и пиримидиновых оснований в молекуле иРНК подбирают определенные АК на рибосомах, из которых формируется пептидная цепочка, которая уже является структурным белком. Из него формируются капсомеры и капсид.
Не учит-т погибш. в теч. 24 ч эмбрионы – травматизм; если не выявлено никаких признаков -2-3 слепых пассажа. Индикация: 1.Макроскопический метод - визуальная оценка видимых изменений в К/Э: 1)зародыш –гибель(не в первые 24 ч); недоразвитость; непропорциональное развитие отдельн. чатей тела; перекруч. шея, сам эмбрион; кровоизлияния на теле (чаще в затылочн. облпсти) – одиночные, множетсвенные, сливные; изменения во внутр. органах (увеличение, переполнение кровью, кровоизлияния, анемия, дистрофия в почках, печени, сердце, желчн. пузыре); 2)ХАО – оспины, кровоизлияния, запустение или переполнение сосудов; 3)жидкости – увелич. объем аллантоисн. жидкости или уменьш. объем амниотической, измен. цвет, консистенция, примеси); 2.Микроскопический метод – световая микроскопия – тельца-включения, ЦПД, симпласты; 3) по гемагглютинир. дей-е вируса – капельная РГА (шпора№55).
45.Культивирование вирусов в клеточных культурах.
1.Подбор: К/К должны быть чувствительны к вирусу, из клеток органа-мишени естествен восприимч. животного без признаков дегенерации; 2.Получение вируссод. материала (шпора№39); 4.Заражение К/К: 1)контактный метод: ротовую пит.среду смывают р-ром Хенкса, в пробирку вносят вируссод. материал (0,1-0,2 мл), распределяют покачиванием, в термостат (t=37, на 1-2ч), вируссод. материал удаляютпромывают р-ром Хенкса, наливают поддерж. пит. среду; 2)диффузный: заражают точечно, вирус из одной зараженной клетки дифундирует в другую; 5.Культивирование вируса в клетках: закрытые пробирки ставят в термостат (t=37) под углом в 5град (матрасы –горизонтально) в роллерах (вращаются).Для каждой пробы – 4-10 пробирок + 4-6 контрольные. При длит.культивировании среду меняют каждые 7 дней. Пробирки проверяют под микроскопом каждый день. 6.Индикация:ЦПД(округление, фрагментация, гибель), РГАд, цветная проба(если индикатор в поддерж. среде меняет цвет, то вируса в К/К нет – клетки продолжают жить, выделяя продукты обмена, смещающие рН в кисл. сторону), бляшкообразование (появляются обесцвеченные зоны погибших от вируса клеток), тельца-включения (свет. микроскопия), РИФ.
24.Синтез вирусных белков. Способы их формирования.
Субстратом для синтеза вирусных белков являются аминокислоты, тождественные аминокислотам белков клетки. Матрицей при синтезе белков у ДНК содержащих вирусов является информационная РНК, которая формируется на вирусной ДНК. Информационные РНК синтезируются из субстратов зараженной клетки. Синтез матричной иРНК осуществляется ДНК зависимой РНК полимеразой, которая присутствует в зараженной клетке или приносится извне с вирусной частицей. Процесс синтеза белков у РНК содержащих вирусов происходит без участия ДНК. Функцию вирусно формационной РНК выполняет вирусоспецифическая РНК.Важнейшим компонентом системы синтеза белка являются рибосомы. При заражении клеток вирусом приостанавливается процесс синтеза новых рибосом при этом высвобождаются старые рибосомы, имеющиеся в клетках, и на них осуществляется синтез белка.Синтез белков у большинства вирусов происходит в цитоплазме. Формирование (морфогенез) зрелых вирусных частиц и их выход из клетки. Зрелая вирусная частица (вирион) формируется из молекул нуклеиновой кислоты и белковых субъединиц. В состав вируса могут входить липопротеидные мембраны и другие компоненты. Синтез вирусспецифического белка зависит от синтеза вирусной иРНК и влияет на него: если синтез белка нарушен, происходит затоваривание вновь образующейся иРНК в местах ее синтеза и тормозится дальнейший ее синтез. Вирусные белки в процессе инфекции синтезируются в избыточном количестве, чем требуется для образования инфекционного вируса. Вирусные белки могут синтезироваться в одних структурах, а накапливаться- в других. На разных стадиях инфекционного цикла могут преимущественно образовываться то одни, то другие группы белков. В зараженной клетке непропорционально накапливаются иРНК с разных вирусных генов. Этот же механизм определяет разную эффективность образования различых белков. Стандартная вирусная частица содержит одну молекулу РНК и до 10 тыс. молекул белков. Помимо структурных белков, в зараженной клетке могут синтезироваться и не-структурные (но кодируемые вирусной РНК) белки.
