Исходные варианты взаимодействия вируса с клеткой. Взаимодействие вируса с клеткой хозяина
Вирусы способны жить и размножаться только в клетках других организмов. Вне клеток организмов они не проявляют никаких признаков жизни. В связи с этим вирусы представляют собой либо внеклеточную покоящуюся форму (варион), либо внутриклеточную реплицирующуюся - вегетативную. Варионы демонстрируют отменную жизнеспособность. В частности, они выдерживают давление до 6000атм и переносят высокие дозы радиации, однако погибают при высоких температуре, облучении УФ - лучами, а также воздействие кислот и дезинфицирующих средств.
Взаимодействии вируса с клеткой последовательно проходят несколько стадий:
- 1. Первая стадия представляет собой адсорбцию варионов на поверхности клетки - мишени, которая для этого должна обладать соответствующими поверхностными рецепторами. Именно с ними специфически взаимодействует вирусная частица, после чего происходит их прочное связывание, по этой причине клетки восприимчивы не ко всем вирусам. Именно этим объясняется строгая определенность путей проникновения вирусов. Например, рецепторы к вирусу гриппа имеются у клеток слизистой оболочки дыхательных путей, а у клеток кожи их нет. Поэтому через кожу гриппом заболеть нельзя - вирусные частицы для этого нужно вдохнуть с воздухом, вирус гепатита А. или В. проникает и размножается только в клетках печени, а вирус эпидемического паротита (свинка)- в клетках околоушных слюнных желез и т.д.
- 2. Вторая стадия состоит в проникновении целого вариона или его нуклеиновой кислоты внутрь клетки-хозяина.
- 3. Третья стадия называется депротеинизация. В ходе ее происходит освобождение носителя генетической информации вируса - его нуклеиновой кислоты.
- 4. В ходе четвертой стадии на основе вирусной нуклеиновой кислоты происходит синтез необходимых для вируса соединений.
- 5. В пятой стадии происходит синтез компонентов вирусной частицы - нуклеиновой кислоты и белков капсида, причем все компоненты синтезируются многократно.
- 6. В ходе шестой стадии из синтезированных ранее многочисленных копий нуклеиновой кислоты и белков формируются новые вирионы путем самосборки.
- 7. Последняя - седьмая стадия - представляет собой выход вновь собранных вирусных частиц из клетки-хозяина. У разных вирусов этот процесс проходит неодинаково. У некоторых вирусов это сопровождается гибелью клетки за счет освобождения литических ферментов лизосом - лизис клетки. У других варионы выходят из живой клетки путем отпочкования, однако и в этом случае клетка со временем погибает.Время, прошедшее с момента проникновения вируса в клетку до выхода новых варионов, называется скрытым или латентным периодом. Оно может широко варьировать: от несколько часов (5-6 у вирусов оспы и гриппа) до нескольких суток(вирусы кори, аденовирусы и др.
Иной путь проникновения в клетку у вирусов бактерий - бактериофагов. Толстые клеточные стенки не позволяют белку-рецептору вместе с присоединившимся к нему вирусом погружаться в цитоплазму, как это происходит при инфицировании клеток животных. Поэтому бактериофаг вводит полый стержень в клетку и вталкивает через нее ДНК (или РНК), находящуюся в его головке. Геном бактериофага попадает в цитоплазму, а капсид остается снаружи. В цитоплазму бактериальной клетки начинается редупликация генома бактериофага, синтез его белков и формирование капсида. Через определенный промежуток времени бактериальная клетка гибнет, и зрелые фаговые частицы выходят в окружающую среду.
Некоторые бактериофаги внутри клетки хозяина не реплицируются. Вместо этого их нуклеиновая кислота включается в ДНК хозяина, образуя с ней единую молекулу, способную к репликации. Такие фаги получили названия умеренных фагов, или профагов. Профаг не оказывает литического воздействия на клетку-хозяина и при делении реплицируется вместе клеточной ДНК. Бактерии, содержащие профаг, называются лизогенными.Они проявляют устойчивость к содержащемуся в них фагу, а так же к близким к нему другим фагам. Связь профага с бактерией весьма прочная, но она может быть нарушена под воздействием индуцирующих факторов(УФ - лучами, ионизирующая радиация, химические мутагены). Следует отметить, что лизигенные бактерии могут менять свойства(например, выделять новые токсины).
Общая вирусология.1 блок
1. Особенности биологии вирусов.
Вирусы – микроорганизмы, составляющие царство Vira. Отличительные признаки:
1) содержат лишь один тип нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК);
2) не имеют собственных белоксинтезирующих и энергетических систем;
3) не имеют клеточной организации;
4) обладают дизъюнктивным (разобщенным) способом репродукции (синтез белков и нуклеиновых кислот происходит в разных местах и в разное время);
6) вирусы проходят через бактериальные фильтры.
Вирусы могут существовать в двух формах: внеклеточной (вириона) и внутриклеточной (вируса). По форме вирионы могут быть:
1) округлыми;
2) палочковидными;
3) в виде правильных многоугольников;
4) нитевидными и др.
Размеры их колеблются от 15–18 до 300–400 нм.
В центре вириона – вирусная нуклеиновая кислота, покрытая белковой оболочкой – капсидом, который имеет строго упорядоченную структуру. Капсидная оболочка построена из капсомеров. Нуклеиновая кислота и капсидная оболочка составляют нуклеокапсид.
Нуклеокапсид сложноорганизованных вирионов покрыт внешней оболочкой – суперкапсидом, которая может включать в себя множество функционально различных липидных, белковых, углеводных структур. Строение ДНК– и РНК-вирусов принципиально не отличается от НК других микроорганизмов. У некоторых вирусов в ДНК встречается урацил.
ДНК может быть:
1) двухцепочечной;
2) одноцепочечной;
3) кольцевой;
4) двухцепочечной, но с одной более короткой цепью;
5) двухцепочечной, но с одной непрерывной, а с другой фрагментированной цепями. РНК может быть:
1) однонитевой;
2) линейной двухнитевой;
3) линейной фрагментированной;
4) кольцевой;
5) содержащей две одинаковые однонитевые РНК.
Вирусные белки подразделяют на:
1) геномные – нуклеопротеиды. Обеспечивают репликацию вирусных нуклеиновых кислот и процессы репродукции вируса. Это ферменты, за счет которых происходит увеличение количества копий материнской молекулы, или белки, с помощью которых на матрице нуклеиновой кислоты синтезируются молекулы, обеспечивающие реализацию генетической информации;
2) белки капсидной оболочки – простые белки, обладающие способностью к самосборке. Они складываются в геометрически правильные структуры, в которых различают несколько типов симметрии: спиральный, кубический (образуют правильные многоугольники, число граней строго постоянно) или смешанный;
3) белки суперкапсидной оболочки – это сложные белки, разнообразные по функции. За счет них происходит взаимодействие вирусов с чувствительной клеткой. Выполняют защитную и рецепторную функции.
Среди белков суперкапсидной оболочки выделяют:
а) якорные белки (одним концом они располагаются на поверхности, а другим уходят в глубину; обеспечивают контакт вириона с клеткой); б) ферменты (могут разрушать мембраны);
в) гемагглютинины (вызывают гемагглютинацию); г) элементы клетки хозяина.
2. Принципы классификации вирусов.
В основу классификации вирусов положены следующие категории:
тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), ее структура, количество нитей (одна или две), особенности воспроизводства вирусного генома;
размер и морфология вирионов, количество капсомеров и тип симметрии;
наличие суперкапсида;
чувствительность к эфиру и дезоксихолату;
место размножения в клетке;
антигенные свойства и пр.
Вирусы имеют уникальный геном, так как содержат либо ДНК, либо РНК. Поэтому различают: а) ДНК-содержащие б) РНК-содержащие вирусы.
Они обычно гаплоидны, т.е. имеют один набор генов. Геном вирусов представлен различными видами нуклеиновых кислот: двунитчатыми, однонитчатыми, линейными, кольцевыми, фрагментированными.
Имеются также РНК-содержащие вирусы с отрицательным (минус-нить РНК) геномом. Минус-нить РНК этих вирусов выполняет только наследственную функцию.
Морфологию вирусов изучают с помощью электронной микроскопии, так как их размеры малы (18-400 нм) и сравнимы с толщиной оболочки бактерий.
Форма вирионов может быть различной:
а) палочковидной (вирус табачной мозаики), б) пулевидной (вирус бешенства), в) сферической (вирусы полио¬миелита, ВИЧ), г) нитевидной (филовирусы),
д) в виде сперматозоида (многие бактериофаги).
Различают просто устроенные и сложно устроенные вирусы.
Простые, или безоболочечные, вирусы состоят из нуклеиновой кислоты и белковой оболочки, называемой капсидом. Капсид состоит из повторяющихся морфологических субъединиц - капсомеров. Нуклеиновая кислота и капсид взаимодействуют друг с другом, образуя нуклеокапсид.
Сложные, или оболочечные, вирусы снаружи капсида окружены липопротеиновой оболочкой (суперкапсидом, или пеплосом). Эта оболочка является производной структурой от мембран вирусинфицированной клетки. На оболочке вируса расположены гликопротеиновые шипы, или шипики (пепломеры). Под оболочкой некоторых вирусов находится матриксный М-белок.
Тип симметрии. Капсид или нуклеокапсид могут иметь спиральный, икосаэдрический (кубический) или сложный тип симметрии. Икосаэдрический тип симметрии обусловлен образованием изометрически полого тела из капсида, содержащего вирусную нуклеиновую кислоту (например, у вирусов гепатита А, герпеса, полиомиелита). Спиральный тип симметрии обусловлен винтообразной структурой нуклеокапсида (например, у вируса гриппа).
3. Методы культивирования вирусов.
Основные методы культивирования вирусов:
1) биологический – заражение лабораторных животных. При заражении вирусом животное заболевает. Если болезнь не развивается, то патологические изменения можно обнаружить при вскрытии. У животных наблюдаются иммунологические сдвиги. Однако далеко не все вирусы можно культивировать в организме животных;
2) культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах. Куриные эмбрионы выращивают в инкубаторе 7-10 дней, а затем используют для культивирования. В этой модели все типы зачатков тканей подвержены заражению. Но не все вирусы могут размножаться и развиваться в куриных эмбрионах.
В результате заражения могут происходить и появляться:
1) гибель эмбриона;
2) дефекты развития: на поверхности оболочек появляются образования – бляшки, представляющие собой скопления погибших клеток, содержащих вирионы;
3) накопление вирусов в аллантоисной жидкости (обнаруживают путем титрования);
4) размножение в культуре ткани (это основной метод культивирования вирусов).
Различают следующие типы культур тканей:
1) перевиваемые – культуры опухолевых клеток; обладают большой митотической активностью;
2) первично трипсинизированные – подвергшиеся первичной обработке трипсином; эта обработка нарушает межклеточные связи, в результате чего выделяются отдельные клетки. Источником являются любые органы и ткани, чаще всего – эмбриональные (обладают высокой митотической активностью).
Для поддержания клеток культуры ткани используют специальные среды. Это жидкие питательные среды сложного состава, содержащие аминокислоты, углеводы, факторы роста, источники белка, антибиотики и индикаторы для оценки развития клеток культуры ткани.
О репродукции вирусов в культуре ткани судят по их цитопатическому действию, которое носит разный характер в зависимости от вида вируса.
Основные проявления цитопатического действия вирусов:
1) размножение вируса может сопровождаться гибелью клеток или морфологическими изменениями в них;
2) некоторые вирусы вызывают слияние клеток и образование многоядерного синцития;
3) клетки могут расти, но делиться, в результате чего образуются гигантские клетки;
4) в клетках появляются включения (ядерные, цитоплазматические, смешанные). Включения могут окрашиваться в розовый цвет (эозинофильные включения) или в голубой (базофильные включения);
5) если в культуре ткани размножаются вирусы, имеющие гемагглютинины, то в процессе размножения клетка приобретает способность адсорбировать эритроциты (гемадсорбция).
4. Вирусологический метод, основные этапы.
Этиологическая диагностика вирусных заболеваний проводится вирусологическим, вирусоскопическим, серологическим и молекулярно-генетическим методами. Три последних метода могут быть использованы как экспресс-диагностические.
Вирусологический метод диагностики.
Конечной целью метода является идентификация вирусов до вида или серологического варианта. Вирусологический метод включает несколько этапов: 1) отбор материала для исследования; 2) обработку вируссодержащего материала; 3) заражение материалом чувствительных живых систем; 4) индикацию вирусов в живых системах; 5) титрование выделенных вирусов; 6) идентификацию вирусов в иммунных реакциях.
1. Отбор материала для исследования. Проводится в ранние сроки заболевания при соблюдении правил, предотвращающих контаминацию материала посторонней микрофлорой и инфицирование медицинского персонала. Для предупреждения инактивации вирусов при транспортировке материала, он помещается в вирусную транспортировочную среду (ВТС), состоящую из сбалансированного солевого раствора, антибиотиков и сывороточного альбумина. Транспортируется материал в специальном контейнере с термоизоляцией и закрытыми пластиковыми пакетами, содержащими лед. При необходимости материал хранят при -20˚С. Каждый образец материала для исследования должен иметь маркировку и этикетку с
указанием фамилии больного, типа материала, даты его забора, развернутый клинический диагноз и другие сведения.
В зависимости от характера заболевания, материалом для исследования могут быть: 1) смывы с носовой части глотки и мазок из глотки; 2) спинномозговая жидкость; 3) кал и ректальные мазки; 4) кровь; 5) моча; 6) жидкость из серозных полостей; 7) мазок с конъюнктивы; 8) содержимое везикул; 8) секционный материал.
Для получения смыва из ротоглотки используют 15-20 мл ВТС. Больной тщательно в течение 1 минуты полощет горло ВТС и собирает смыв в стерильный флакон.
Мазок с задней стенки глотки берут стерильным ватным тампоном, надавливая на корень языка шпателем. Тампон помещают в 2-3 мл ВТС, ополаскивают и отжимают.
Спинномозговую жидкость получают при спинномозговой пункции. 1-2 мл спинномозговой жидкости помещают в стерильную посуду и доставляют в лабораторию.
Пробы кала отбирают в течение 2-3 дней в стерильные флаконы. Из полученного материала готовят 10 % суспензию с использованием раствора Хенкса. Суспензию центрифугируют при 3000 об/мин, собирают надосадочную жидкость, вносят в нее антибиотики и помещают в стерильную посуду.
Кровь, полученную при венепункции в объеме 5-10 мл, дефибринируют путем добавления гепарина. Цельную кровь не замораживают, антибиотики не добавляют. Для получения сыворотки пробы крови выдерживают в термостате при 37˚С в течение 60 минут.
Жидкость из серозных полостей получают при их пункции в количестве 1-2 мл. Жидкость используется сразу или сохраняется в замороженном состоянии.
Мазок с конъюнктивы берут стерильным тампоном и помещают в ВТС, после чего проводят центрифугирование взятого материала и его замораживание.
Содержимое везикул отсасывают шприцем с тонкой иглой и помещают в ВТС. Материал посылается в лабораторию в виде высушенных мазков на предметных стеклах или в запаянных стерильных капиллярах или ампулах.
Секционный материал отбирают в возможно ранние сроки, соблюдая правила асептики. Для отбора каждой пробы используют отдельные наборы стерильных инструментов. Количество отбираемых тканей составляет 1-3 г, которые помещают в стерильные флаконы. Вначале берут пробы внеполостных органов (мозг, лимфатические узлы и др.). Ткани грудной полости берут до вскрытия брюшной полости. Полученные образцы тканей растирают в ступке с добавлением стерильного песка и стерильного раствора натрия хлорид, после чего материал центрифугируют. Надосадочную жидкость собирают во флаконы, добавляют антибиотики. Материал для вирусологического исследования используется сразу или хранится при -20˚С.
2. Обработка вируссодержащего материала. Проводится с целью освобождения материала от сопутствующей бактериальной микрофлоры. Для этого используются физические и химические методы. Физические методы: 1) фильтрование через различные бактериальные фильтры; 2) центрифугирование. Химические методы: 1) обработка материала эфиром в случаях выделения вирусов, не имеющих суперкапсида; 2) добавление к материалу смеси гептана и фреона; 3) внесение антибиотиков (пенициллин – 200-300 ЕД/мл; стрептомицин – 200-500 мкг/мл; нистатин – 100-1000 ЕД/мл).
Лабораторные животные. Используются белые мыши, морские свинки, хомяки, кролики и др. Белые мыши наиболее чувствительны к большому числу видов вирусов. Способ заражения животных определяется тропизмом вируса к тканям. Заражение в мозг применяется при выделении нейротропных вирусов (вирусы бешенства, полиовирусы и др.). Интраназальное заражение проводят при выделении возбудителей респираторных инфекций. Широко используются внутримышечный, внутривенный, внутрибрюшинный,
подкожный и другие методы заражения. Заболевших животных усыпляют эфиром, вскрывают и производят забор материала из органов и тканей.
Куриные эмбрионы. Широко доступны и просты в работе. Применяют куриные эмбрионы в возрасте от 5 до 14 дней. Перед заражением куриные эмбрионы овоскопируют: определяют их жизнеспособность, отмечают на скорлупе границу воздушного мешка и месторасположение эмбриона («темный глаз» эмбриона). Работа с куриными эмбрионами проводится в стерильном боксе стерильными инструментами (пинцеты, шприцы, ножницы, копье и др.). После выполнения фрагмента работы инструменты погружают в 70 % этиловый спирт и перед следующей манипуляцией прожигают. Перед заражением скорлупу куриного эмбриона протирают горящим спиртовым тампоном и спиртовым раствором йода. Объем исследуемого материала, вводимого в эмбрион, составляет 0,1-0,2 мл. Для выделения вирусов из одного материала используют не менее 4 куриных эмбрионов.
5. Этапы взаимодействия вирусов с чувствительными клетками и факторы, способные их нарушать.
Взаимодействие вириона с живой клеткой осуществляется в несколько этапов. В начальный (подготовительный) период вирион прикрепляется к клетке, проникает внутрь ее, после чего белковая оболочка вириона разрушается, освобождая нуклеиновую к-ту (3). Наступает скрытый (латентный) период вирусной инфекции, во время к-рого присутствие в зараженной клетке вирусных частиц нельзя обнаружить никакими методами - родительский вирион как бы исчезает. В этот период проникшая в клетку вирусная нуклеиновая к-та организует синтез вирусных компонентов потомства, используя для этой цели ферментативную систему хозяина. Цикл размножения заканчивается формированием дочерних вирионов и выходом их из клетки (конечный период).
Более просто устроенные бактерии не способны сами захватывать частицы из окружающей среды. Поэтому у бактериофагов имеются спец. приспособления для преодоления плотной бактериальной стенки. В концевой части хвоста содержится особый фермент, к-рый растворяет бактериальную оболочку. Затем микроскопические «мышцы» хвоста сокращаются и нуклеиновая к-та фага «впрыскивается» внутрь клетки, происходит как бы инъекция с помощью шприца. В результате белковый чехол фага остается на поверхности клетки, а внутрь клетки попадает лишь нуклеиновая к-та.
Нуклеиновые к-ты В. осуществляют программу по созданию в клетке нового вирусного потомства. Это было доказано оригинальными опытами. Удалось разделить В. на составляющие их компоненты - белки и нуклеиновые к-ты. Оказалось, что заражение клеток и размножение В. происходило только после добавления к клеткам вирусной нуклеиновой к-ты. Иными словами, нуклеиновые к-ты В. сами по себе могут вызывать размножение В., т. е. обладают инфекционными свойствами. В другом опыте два В. были разделены на составляющие компоненты, а затем «переодеты»: нуклеиновую к-ту одного В. «одели» в оболочку другого. Полученными гибридами были заражены чувствительные клетки. Было обнаружено, что оба «переодетых» В. способны размножаться, а образующееся потомство всегда подобно тому В., нуклеиновую к-ту к-рого содержал гибрид.
Проникшая в клетку вирусная нуклеиновая к-та управляет всеми процессами размножения В. Сначала она заставляет клетку синтезировать так называемые ранние белки, подавляющие собственный обмен веществ клетки и обеспечивающие синтез нуклеиновых к-т дочерних частиц. Образование их происходит в результате самокопирования родительской нуклеиновой к-ты. Генетическая информация, заложенная в нуклеиновой к-те В., определяет состав белков, из к-рых строятся дочерние частицы так наз. поздних белков. В ДНК-со держащих В. реализация этой информации осуществляется обычным для клетки путем: на ДНК синтезируется информационная РНК (транскрипция), управляющая последующим биосинтезом белков (трансляция). В нуклеиновой к-те многих РНК-содержащих В. объединены и генетическая, и информационная функции: РНК участвует и в репликации, и в трансляции (в воспроизводстве нуклеиновых кислот и белка В.).
У многих В. построение белковых оболочек и внутреннего содержимого идет раздельно. Клетка «нарабатывает» отдельные детали, к-рые потом соединяются, образуя вирусные частицы. Когда в зараженной клетке накопится достаточное количество «заготовок > для будущих вирусных частиц, наступает как бы сборка деталей (композиция). Процесс этот происходит обычно вблизи клеточной оболочки, к-рая принимает в нем участие (4). В составе вирусной частицы часто обнаруживаются вещества, характерные для клетки, в к-рой размножается В. Напр., у В. гриппа заключительный этап формирования вирусной частицы - своеобразное обволакивание ее слоем клеточной мембраны. Т. о., клетка не только «кормит» и «поит» В., но на прощание еще и «одевает» их.
Последний этап взаимодействия В. и клетки, как правило, непродолжителен. Образовавшиеся полноценные вирусные частицы быстро выходят во внешнюю среду. Весьма своеобразно происходит выход потомства у бактериофагов. Он сопровождается обычно растворением (лизисом) бактериальных клеток под действием особого фермента, к-рый накапливается в клетке параллельно размножению фага и приводит ее к разрушению и гибели. Под микроскопом хорошо видно, как это происходит. Иногда бактерии как бы взрываются, в других случаях в бактерии (в середине или на одном из концов) образуется отверстие, через к-рое вытекает ее содержимое. Из одной погибшей бактерии может освободиться до нескольких сотен новых частиц фага. Процесс размножения фагов продолжается до тех пор, пока не будут уничтожены все чувствительные к этому фагу бактерии. Для В. оспы, полиомиелита, энцефалитов также характерен быстрый выход в окружающую среду сотен, а порой тысяч дочерних вирионов. Другие В. человека и животных (В. герпеса, свинки, реовирусы) выходят из клеток по мере созревания. Эти В. до момента гибели клеток успевают проделать несколько циклов размножения, постепенно истощая синтетические ресурсы клеток и вызывая их разрушение. В отдельных случаях В. могут накапливаться внутри клеток, образуя кристаллоподобные скопления (В. бешенства, аденовирусы и др.), к-рые называют тельцами включений (5). При гриппе, бешенстве, пситтакозе, оспе такие тельца обнаруживают в цитоплазме клеток, при весеннелетнем энцефалите, желтой лихорадке, герпесе и полиомиелите - в ядре; при нек-рых инфекциях тельца включений находили как в ядре, так и в цитоплазме. Исследования последних лет показали, что в подавляющем большинстве случаев эти включения представляют собой колонии В., причем их образование закономерно на определенной стадии размножения возбудителей инфекции. Высокая специфичность внутриклеточных включений при вирусных заболеваниях позволяет использовать этот признак для диагностики. Напр., обнаруженные в нервных клетках головного мозга ци-топлазматические включения (так наз. тельца Негри) являются основным доказательством заболевания бешенством, а специфич. образования круглой или овальной формы (так наз. тельца Гвар-ниери), обнаруженные в эпителиальных клетках, указывают на заболевание оспой. Включения описаны также при энцефалите, детском спинномозговом параличе, ящуре и других заболеваниях. Очень своеобразные включения, имеющие кристаллическую форму, образуют вирусы растений.
Т. о., размножение В. происходит особым, ни с чем не сравнимым способом. Сначала вирусные частицы проникают внутрь клеток и освобождаются вирусные нуклеиновые к-ты. Затем заготавливаются детали будущих вирусных частиц. Размножение заканчивается сборкой новых вирусных частиц и выходом их в окружающую среду. Выпадение любого из указанных этапов приводит к нарушению нормального цикла и влечет за собой либо полное подавление размножения В., либо появление неполноценного потомства.
Основные этапы взаимодействия вируса с клеткой хозяина.
1.Адсорбцияпусковой механизм, связанный со взаимодействием специфических рецепторов вируса и хозяина (у вируса гриппагемагглютинин, у вируса иммунодефицита человекагликопротеин gp 120).
2.Проникновениепутем слияния суперкапсида с мембраной клетки или путем эндоцитоза (пиноцитоза).
3.Освобождение нуклеиновых кислот- ―раздевание‖ нуклеокапсида и активация нуклеиновой кислоты.
4.Синтез нуклеиновых кислот и вирусных белков, т.е. подчинение систем клетки хозяина и их работа на воспроизводство вируса.
5.Сборка вирионовассоциация реплицированных копий вирусной нуклеиновой кислоты с капсидным белком.
6.Выход вирусных частиц из клетки, приобретения суперкапсида оболочечными вирусами.
6. Формы вирусной инфекции.
На уровне макроорганизма основные формы вирусных поражений принципиально не отличаются от таковых, наблюдаемых при инфицировании вирусами отдельных клеток.
Продуктивная вирусная инфекция с образованием дочерних популяций и характерными клиническими проявлениями возможна лишь при наличии в заражённом организме чувствительных клеток, в которых осуществляется репродуктивный цикл возбудителя. Например, возбудитель полиомиелита может реплицировать только в клетках ЖКТ и ЦНС приматов и человека.
Абортивная инфекция развивается при проникновении возбудителя в нечувствительные клетки (например, при попадании вируса лейкоза коров в организм человека) либо в клетки, не способные обеспечить полный репродуктивный цикл (например, находящиеся в стадии клеточного цикла G0). Способность клеток к
поддержанию вирусспецифических репродуктивных процессов также подавляет ИФН, противовирусный эффект которого направлен против самых различных вирусов.
Персистирующая вирусная инфекция возникает при таком взаимодействии между вирусом и заражённой клеткой, когда в последней продолжается выполнение собственных клеточных функций. Если заражённые клетки делятся, образуется инфицированный клон. Таким образом, увеличение числа заражённых клеток способствует увеличению общей популяции возбудителя в организме. Тем не менее персистирующие вирусные инфекции обычно нарушают функции клеток, что в конце концов приводит к клиническим проявлениям. У человека развитие персисти-рующих инфекций в определённой степени зависит от возраста. Например, внутриутробное заражение вирусом коревой краснухи или цитомегаловирусом (ЦМВ) приводит к ограниченному по времени персистированию возбудителя. Появление симптоматики связано с возможностью плода развивать иммунные реакции на инфекционный агент.
Латентная (скрытая) вирусная инфекция. В то время как персистирующие инфекции сопровождаются постоянным высвобождением дочерних вирусных популяций, при латентных поражениях они образуются спорадически. Репродуктивный цикл подобных возбудителей резко замедляется на поздних стадиях и активируется под влиянием различных факторов. Латентные инфекции характерны для большинства герпесвирусов, вызывающих рецидивирующие и обычно не прогрессирующие заболевания. Инаппарантные инфекции *от лат. in-, отрицание, + арраrео, являться+ сопровождаются бессимптомной циркуляцией незначительных количеств возбудителя в отдельных органах. При этом выявить возбудителя можно лишь специальными методами. От бессимптомного носительства подобные поражения отличает большая вероятность возникновения клинических проявлений. Этот термин применяют при целом ряде инфекций, при которых нет явных признаков заболевания. В практике вирусных инфекций у человека часто применяют альтернативный термин «субклиническая инфекция». Собственно, и латентные инфекции можно расценивать как хронически протекающие инаппаратные инфекции, при которых устанавливается баланс между организмом и возбудителем.
Дремлющая (криптогенная) вирусная инфекция - форма проявления вирусной инфекции при которой возбудитель в неактивном состоянии находится в отдельных очагах (например, в нервных ганглиях). Клинически инфекция проявляется лишь при резком ослаблении защитных сил организма. Например, вирус герпеса 3 типа, вызывающий при первичном заражении ветряную оспу, пожизненно сохраняется в организме. Рецидив заболевания в форме опоясывающего лишая возможен лишь при нарушениях иммунного статуса (наиболее часто в пожилом возрасте).
Медленные вирусная инфекции характеризуются длительным инкубационным периодом (месяцы и годы), в течение которого возбудитель размножается, вызывая всё более явные повреждения тканей. Первоначально возбудитель размножается в ограниченной группе клеток, но постепенно инфицирует всё большее их число. Заболевания заканчиваются развитием тяжёлых поражений и смертью больного. К медленным вирусным инфекциям относят подострый склерозирующий панэнцефалит, ВИЧ-инфекцию и др.
7. Особенности противовирусного иммунитета.
Противовирусный иммунитет начинается со стадии презентации вирусного антигена Т-хелперами.
Сильными антигенпрезентирующими свойствами при вирусных инфекциях обладают дендритные клетки, а при простом герпесе и ретровирусных инфекциях – клетки Лангерганса.
Иммунитет направлен на нейтрализацию и удаление из организма вируса, его антигенов и зараженных вирусом клеток. Антитела, образующиеся при вирусных инфекциях, действуют непосредственно на вирус или на клетки, инфицированные им. В этой связи выделяют две основные формы участия антител в развитии противовирусного иммунитета:
1) нейтрализацию вируса антителами; это препятствует рецепции вируса клеткой и проникновению его внутрь. Опсонизация вируса с помощью антител способствует его фагоцитозу;
2) иммунный лизис инфицированных вирусом клеток с участием антител. При действии антител на антигены, экспрессированные на поверхности инфицированной клетки, к этому комплексу присоединяется комплемент с последующей его активацией, что и обуславливает индукцию комплементзависимой цитотоксичности и гибель инфицированной вирусом клетки.
Недостаточная концентрация антител может усиливать репродукцию вируса. Иногда антитела могут защищать вирус от действия протеолитических ферментов клетки, что при сохранении жизнеспособности вируса приводит к усилению его репликации.
Вируснейтрализующие антитела действуют непосредственно на вирус лишь в том случае, когда он, разрушив одну клетку, распространяется на другую.
Когда вирусы переходят из клетки в клетку по цитоплазматическим мостикам, не контактируя с циркулирующими антителами, то основную роль в становлении иммунитета играют клеточные механизмы, связанные прежде всего с действием специфических цитотоксических Т-лимфоцитов, Т-эффекторов и макрофагов. Цитотоксические Т-лимфоциты непосредственно контактируют с клеткой-мишенью, повышая ее проницаемость и вызывая осмотическое набухание, разрыв мембраны и выход содержимого в окружающую среду.
Механизм цитотоксического эффекта связан с активацией мембранных ферментных систем в зоне прилипания клеток, образованием цитоплазматических мостиков между клетками и действием лимфотоксина. Специфические Т-киллеры появляются уже через 1–3 дня после заражения организма вирусом, их активность достигает максимума через неделю, а затем медленно понижается.
Одним из факторов противовирусного иммунитета является интерферон. Он образуется в местах размножения вируса и вызывает специфическое торможение транскрипции вирусного генома и подавление трансляции вирусной мРНК, что препятствует накоплению вируса в клетке-мишени.
Стойкость противовирусного иммунитета вариабельна. При ряде инфекций (ветряной оспе, паротите, кори, краснухе) иммунитет достаточно стойкий, а повторные заболевания встречаются крайне редко. Менее стойкий иммунитет развивается при инфекциях дыхательных путей (гриппе) и кишечного тракта.
8. Интерфероны. Их роль в противовирусном иммунитете.
Интерферон (от лат. inter – взаимно и ferio – поражать) – фактор белковой природы, который обеспечивает противовирусный иммунитет. Интерферон выделяется клетками позвоночных животных (лимфоцитами и макрофагами) в ответ на действие индукторов (при их контакте с вирусами). Интерферон угнетает репродукцию вирусов путем уменьшения количества чувствительных к ним клеток. Механизм противовирусного действия интерферона связан, очевидно, с образованием некоторых метаболитов, которые угнетают синтез видоспецифических вирусных белков.
Образование интерферона, кроме действия вирусов, может индуцироваться некоторыми микроорганизмами и продуктами их жизнедеятельности, синтетическими полирибонуклеотидами и другими соединениями.
Особенностью интерферона является то, что он проявляет активность лишь в организмах, из которых он был выделен, т.е. является видовым фактором. Молекулярная масса интерферона зависит от вида животных, который его продуцирует, и составляет 13–170 тыс. Известно несколько видов интерферонов, среди которых наиболее важное значение имеют альфа-, бета- и гамма-интерфероны. В организме человека образуются в основном альфа1-, альфа2- и альфа3-интерфероны. Молекулярная масса их составляет 18–25 тыс., реже от 5,5 до 7,5 тыс. На N-конце молекул интерферонов, как правило, содержится остаток цистеина, который принимает участие в образовании дисульфидной связи, важной для их биологического действия. В настоящее время интерфероны эффективно используются для лечения вирусных, респираторных и инфекционных заболеваний. Внедрен микробиологический синтез интерферона с применением методов генной инженерии. Ген интерферона внедряют в геном бактерии E.coli, которая и обеспечивает его синтез.
У рыб, птиц, рептилий, как и у млекопитающих, обнаружены противовирусные вещества широкого спектра действия – интерфероны. Впервые они были обнаружены при изучении вирусной интерференции, когда животное, зараженное одним вирусом, устойчиво к заражению другим неродственным вирусом.
Типы интерферонов
Идентифицированы различные типы интерферонов; гены каждого из них клонированы. Существуют по меньшей мере 14 альфа-интерферонов, которые продуцируются лимфоцитами. Бета-интерфероны продуцируются фибробластами. Образование гамма-интерферонов не индуцируется вирусами.
Механизм противовирусного действия интерферонов
При вирусной инфекции клетки синтезируют интерферон и секретируют его в межклеточное пространство, где он связывается со специфическими рецепторами соседних незараженных клеток.
Связанный интерферон оказывает противовирусное действие следующим образом. В клетке, подвергшейся воздействию интерферона, депрессируются по меньшей мере два гена и начинается синтез двух ферментов.
Первый – протеинкиназа – фосфорилирует рибосомальный белок и фактор инициации, необходимый для синтеза белка, тем самым значительно снижая трансляцию мРНК.
Второй фермент катализирует образование короткого полимера адениловой кислоты, активирующего латентную эндонуклеазу, что приводит к деградации мРНК как вируса, так и хозяина.
9. Принципы профилактики вирусных инфекций. Группы применяемых препаратов при вирусных инфекциях.
Для активной искусственной профилактики вирусных инфекций, в том числе и для плановой профилактики, широко используются живые вирусные вакцины. Они стимулируют резистентность в месте входных ворот инфекции, образование антител и клеток-эффекторов, а также синтез интерферона.
Основные живые вирусные вакцины: гриппозная, коревая,
полиомиелитная (Сейбина-Смородинцева-Чумакова), паротитная, против коревой краснухи, антирабическая, против желтой лихорадки,
генно-инженерная вакцина против гепатита В - Энджерикс В.
Для профилактики вирусных инфекций используются и убитые вакцины: против клещевого энцефалита, омской геморрагической лихорадки, полиомиелита (Солка), гепатита А (Харвикс 1440),
антирабическая (ХДСВ, Пастер Мерье), а также и химические - гриппозные.
Для пассивной профилактики и иммунотерапии предложены следующие антительные препараты: противогриппозный гамма-глобулин, антирабический гамма-глобулин,
противокоревой гамма-глобулин для детей до 2 лет (в очагах) и для ослабленных детей старшего возраста, противогриппозная сыворотка с сульфаниламидами.
Универсальным средством пассивной профилактики вирусных инфекций являются интерферон и индукторы эндогенного интерферона.
Большинство известных химиотерапевтических препаратов не обладают противовирусной активностью, так как механизм действия большинства из них основан на подавлении микробного метаболизма, а у вирусов собственные метаболические системы отсутствуют. Антибиотики и сульфаниламиды при вирусных инфекциях используют только с целью профилактики бактериальных осложнений. Тем не менее в настоящее время разрабатываются и применяются химиотерапевтические средства, обладающие противовирусной активностью.
Первая группа - аномальные нуклеозиды. По строению они близки к нуклеотидам вирусных нуклеиновых кислот, но, включенные в состав нуклеиновой кислоты, они не обеспечивают ее нормальное функционирование. К таким препаратам относятся азидотимидин - препарат, активный в отношении вируса иммунодефицита человека (ВИЧинфекция). Недостаток этих препаратов - в высокой токсичности для клеток макроорганизма.
Вторая группа препаратов нарушает процессы абсорбции вирусов на клетках. Они менее токсичны, обладают высокой избирательностью и весьма перспективны. Это тиосемикарбозон и его производные, ацикловир (зовиракс) - герпетическая инфекция, ремантадин и его производные - грипп А и др.
Универсальным средством терапии, так же как и профилактики, вирусных инфекций является интерферон.
10. Серодиагностика вирусных инфекций, используемые реакции.
Серологические методы диагностики вирусных инфекций. Торможение гемагглютинации. Торможение цитопатического эффекта интерференцией вирусов. Прямая иммунофлюоресценция. Иммуноэлектронная микроскопия. При большинстве вирусных инфекций развиваются иммунные реакции, применяемые для диагностики. Клеточные реакции обычно оценивают в тестах цитотоксичности лимфоцитов в отношении инфекционных агентов или заражѐнных ими клетокмишеней либо определяют способность лимфоцитов отвечать на различные Аг и митогены. В работе практических лабораторий выраженность клеточных реакций определяют редко. Большее распространение нашли методы идентификации противовирусных AT. РН основана на подавлении цитопатогенного эффекта после смешивания вируса со специфичными AT. Неизвестный вирус смешивают с известными коммерческими антисыворотками и после соответствующей инкубации вносят в монослой клеток. Отсутствие гибели клеток указывает на несоответствие инфекционного агента и известных AT. Торможение гемагглютинации РТГА применяют для идентификации вирусов, способных агглютинировать различные эритроциты. Для этого смешивают культуральную среду, содержащую возбудитель, с известной коммерческой антисывороткой и вносят в культуру клеток. После инкубации определяют способность культуры к гемагглютинации и при еѐ отсутствии делают заключение о несоответствии вируса антисыворотке. Торможение цитопатического эффекта интерференцией вирусов Реакцию торможения цитопатического эффекта за счѐт интерференции вирусов применяют для идентификации возбудителя, интерферирующего с известным цитопатогенным вирусом в культуре чувствительных клеток. Для этого в культуральную среду, содержащую изучаемый вирус, вносят коммерческую сыворотку (например, к вирусу краснухи при подозрении на неѐ), инкубируют и заражают вторую культуру; через 1-2 дня в неѐ вносят известный цитопатогенный вирус (например, любой ЕСНО-вирус). При наличии цитопатогенного эффекта делают вывод о том, что первая культура была заражена вирусом, соответствовавшим применѐнным AT. Прямая иммунофлюоресценция Среди прочих тестов наибольшее распространение нашла реакция прямой иммунофлюоресценции (наиболее быстрая, чувствительная и воспроизводимая). Например, идентификация ЦМВ по цитопатогенному эффекту требует не менее 2-3 нед, а при использовании меченых моноклона л ьных AT идентификация возможна уже через 24 ч. Имея набор подобных реагентов, их можно вносить в культуры, заражѐнные вирусом, инкубировать, отмывать несвязавшийся реагент и исследовать с помощью люминесцентной микроскопии (позволяет выявить наличие флюоресценции заражѐнных клеток). Иммуноэлектронная микроскопия Иммуноэлектронная микроскопия (аналог предыдущего метода) позволяет идентифицировать различные виды вирусов, выявленные электронной микроскопией (например, различные виды герпесвирусов), что невозможно сделать, основываясь на морфологических особенностях. Вместо антисывороток для идентификации используют помеченные разными способами AT, но сложность и дороговизна метода ограничивают его применение.
Выявление противовирусных антител (AT) в сыворотке крови. РТГА. РСК. РИФ. Иммуносорбционные методы выявления противовирусных антител. Более простой и доступный подход - выявление противовирусных антител (AT) в сыворотке. Образцы крови необходимо отбирать дважды: немедленно после появления клинических признаков и через 2~3 нед. Чрезвычайно важно исследовать именно два образца сыворотки. Результаты однократного исследования нельзя считать окончательными из-за невозможности связать появление AT с настоящим случаем. Вполне возможно, что эти AT циркулируют после предшествующей инфекции. В подобной ситуации роль исследования сыворотки, полученной в период рекон-валесценции, трудно переоценить. На наличие заболевания в период отбора первой пробы указывает не менее чем четырѐхкратное увеличение титра AT, выявленное при исследовании второй пробы. Перечисленные ниже методы не позволяют дифференцировать антитела (AT), образующиеся во время болезни и циркулирующие после выздоровления (продолжительность этого периода вариабельна для различных инфекций). Поскольку для адекватной диагностики необходимо подтвердить достоверное увеличение титров AT в двух пробах, то первую пробу исследуют в острой фазе, а вторую - в период выздоровления (через 2-3 нед). Полученные результаты носят ретроспективный характер и более пригодны для проведения эпидемиологических обследований. РТГА выявляет AT, синтезируемые против гемагглютининов вирусов (например, вируса гриппа). Метод позволяет легко выявлять подобные антитела (AT) в сыворотке больного. РСК - основной метод серодиагностики вирусных инфекций (среди доступных). Реакция выявляет комплементсвязывающие IgM и IgG, но не дифференцирует их; для оптимизации получаемых результатов постановка реакции требует определѐнных навыков персонала. РИФ. При возможности получить биоптат инфицированной ткани и доступности коммерческих наборов AT,
Блок 1
Особенности биологии вирусов. Принципы классификации вирусов.
Особенности размножения (этапы репродукции):
1. Избирательная адсорбция на клеточных рецепторах (прикрепление)
2. Рецептор-опосредованный эндоцитоз:
· Клатрин-зависимый;
· Кавиолин-зависимый;
· Клатрин-кавиолиннезависимый;
Взаимодействие с рецепторами – деполимеризация клатрина – образование пиноцитозного пузырька – вход в ЦП
Ранняя эндосома – поздняя эндосома
3. Раздевание (депротеинизация) (у оболочечных+слияние ЦПМ клетки и суперкапсида): ЭКЛИПС
4. Синтез макромолекул:
· Синтез ранних мРНКнеструктурных белков (полимеразы, вирусные протеазы, регуляторы скорости репликации);
· Репликация генома:
Ø +РНК: в ЦП;
Ø -РНК: достройка до +РНК;
Ø ДНК: в ядре;
Ø Ретротранскрипция: -РНК –ДНК.
· Синтез структурных белков (белки капсида и суперкапсида, ферменты) и поздних мРНК;
· Посттрансляционная модификация белка.
** Возможна интеграция генетического материала вируса в геном хозяина (гепатит В, герпес, ВИЧ)
Провирус – интегрированная в геном клетки вирусная ДНК
5. Сборка вирионов:
· ДНК-вирусы: в ядре;
· РНК-вирусы: в ЦПМ.
Гликопротеины сложных вирусов транспортируются к ЦПМ или накапливаются в ЭПР
6. Выход вирионов:
· Литический тип репродукции: полиомиелит
· Нелитический тип: путем почкования – гепатит В
Классификация
1. По строению:
2. По типу НК:
· РНК (80% всех вирусов) (Ретровирусы, Рабдовирусы, Пикорновирусы, Коронавирусы):
Ø +РНК цепь: используется в качестве мРНК и генома (полиовирус);
Ø -РНК цепь: служит геномом, в качестве мРНК – достраивается комплиментраная +РНК цепь (парагрипп);
Ø Двуцепочечная
· ДНК (у многих бактериофагов) (Аденовирусы, Герпесвирусы, Парвовирусы):
Ø Двуцепочечная (герпес);
Ø Одноцепочечная (првовирусы);
Ø Двунитчатая кольцевая (папилломавирус);
Ø Двунитчатая кольцевая с дефектом одной цепи (геатит В)
3. По размеру вирионов:
· Крупные;
· Средние;
· Мелкие.
4. По форме вирионов:
· Спиральная симметрия (Вирус бешенства);
· Икосаэдрическая симметрия (Аденовирус человека).
Тропность к тканям и клеткам.
6. По механизму передачи:
· Аэрогенный (грипп, ротавирус);
· Фекально – оральный (энтеровирусы, ротавирус);
· Трансмиссивный (лихорадка Западного Нила);
· Контактный (оспа, бешенство, ВИЧ, ЦМВ, гепатит).
7. По классу поражаемых хозяев:
· Зоонозы:
Ø Бруцеллез – свиньи;
Ø Сибирская язва – КРС;
Ø Энцефалит - клещи;
Ø Болезнь Лайма;
Ø Лептоспирроз.
· Антропонозы;
· Антропозоонозы:
Ø Туберкулез;
Ø Чума (легочная);
Ø Сальмонеллез.
Вирусологический метод, основные этапы.
Способ обнаружения и идентификации вирусов посредством культивирования; являет собой выделение вируса из патологического материала на восприимчивой живой системе.
Идентификация: противовирусные препараты или сыворотки.
Этапы
1. Подготовка материала (фекалии, носоглоточные смывы, спинномозговая жидкость, кровь, моча, мазок с конъюнктивы):
· Фильтрация через бактериальные фильтры;
· Обработка антимикробными и антигрибковыми препаратами.
2. Подбор модели:
Живые системы.
· Культура клеток (специально культивированные среды):
Существует 2 типа культур: суспензионная культура и монослой клеток, который помещается в специальный сосуд – «матрас»
*Матрас: сосуд, покрытый соединением (коллаген) для заякоривания клеток на стенке, используются высокочистые марки агара.
Классификация:
v Первичные/неперевиваемые: культура каждый раз получается из исходной ткани.
v Перевиваемые: адаптированы к условиям invitro (культура Хеля: карцинома шейки матки; Hep – 2 рак гортани): раковые клетки, способные к нелимитированному делению («вечные клеточные культуры»); образуют многослойные культуры.
v Полуперевиваемые (эмбриональные клетки – для производства вакцин), не способы к злокачественному перерождению; способны совершить до 50 делений (лимит Хейфлика); образуют монослой клеток.
· Эмбрионы птиц (малоинформативные);
· Лабораторные животные (наблюдение клинических проявлений).
3. Заражение.
4. Оценка феноменов присутствия вирусов:
· Цветная проба Солка (для суспензионных культур):
· Феномен Дюльбенко (культура на агаре)
· В монослое:
Ø Образование синцития – корь;
Ø Окружности вирионов с полостями – полиомиелит;
Ø Группы вирионов между фибробластами– аденовирус;
Ø Гемадсорбция – грипп
5. Титрование вируса
6. Идентификация:
· Прямое обнаружение АГ вируса: РИФ, ИФА, РНГА
· Серодиагностика:
Ø ИФА, РСК, РНГА;
Ø РНЦПД (в монослое)
· Генодиагностика (ПЦР);
· Цитоскопия:
Ø ТельцпБабеша-Негри (гиппокамп): бешенство;
Ø Совиный глаз: ЦМВ;
Ø Пустое ядрышко: аденовирус.
Этапы взаимодействия вирусов с чувствительными клетками и факторы, способные их нарушить.
1. Адсорбция: взаимодействие специфических рецепторов ЦПМ клетки и адгезинов на поверхности вириона.
Поврежденные клетки могут не иметь специфических рецепторов
2. Пенетрация: слияние суперкапсида с мембраной клетки (для сложных вирусов) или клатрин/кавиолин-зависимый эндоцитоз (для простых)
3. Раздевание (освобождение от нуклеокапсида) и активация НК.
4. Синтез НК и вирусных белков
5. Сборка вириона: ассоциация ген. материала и капсидного белка
6. Выход из клетки и приобретение суперкапсида (для сложных)
Формы вирусной инфекции.
По локализации.
1. Очаговая: короткий инкубационный период, вирусы размножаются в органах, не попадая в кровь и лимфу. Характерен короткий и нестойкий иммунитет. В основном – респираторные инфекции.
2. Генерализованная: длительный инкубационный период; возбудители с кровью и лимфой разносятся по всему организму, поражая восприимчивые ткани. Иммунитет – длительный и стойкий.
По длительности.
1. Острое заболевание (часто): ярко выраженные клинические проявления; как правило, завершается освобождение организма от вирусов и выздоровлением, но возможна хронизация при условии некорректного лечения.
2. Инаппарантная форма: атипичная острая инфекция (отсутствуют характерные для острого процесса симптомокомплексы).
3. Медленные инфекции: многомесячный инкубационный период, после которого проявляются симптомы, всегда заканчивается летально (ВИЧ - инфекция, бешенство, проказа).
4. Хроническая форма (персистенция): протекают в течении нескольких месяцев (бруцеллез);
· Ремиссия: улучшение состояния, незначительное проявление либо отсутствие симптомов;
· Рецидив: обострение патологического процесса, ясное проявление клиники.
По числу возбудителей.
1.Моноинфекция: вызвана патогеном одного вида.
2. Смешанная форма: инфицирование происходит несколькими вирусами; при этом возможны их взаимовлияния, проявляющиеся в подавлении или усилении действия возбудителей на организм.
Типы взаимодействия вируса с клеткой (формы инфекции):
Ø продуктивный – репродукция вируса с образованием новых вирионов и гибелью клетки;
Ø абортивный – нарушение репродукции вируса на одном из этапов;
Ø интегративный (вирогения) – встраивание вирусной нуклеиновой кислоты в клеточный геном в виде провируса.
Клетка может быть поражена только одним вирусом – это явление получило название феномена интерференции.
Стадии взаимодействия вируса с клеткой:
1. Адсорбция вируса на рецепторах чувствительной клетки с помощью прикрепительных белков капсида/гликопротеиновых шипиков суперкапсида – происходит в две фазы:
Ø неспецифическая – электростатическое межмолекулярное притяжение (обратима);
Ø специфическая – комплементарное связывание рецепторов чувствительной клетки и вируса, обусловленное структурной гомологией (необратима).
2. Проникновение вируса в клетку – может происходить несколькими путями:
Ø рецепторный эндоцитоз (виропексис) – впячивание ЦПМ внутрь клетки с захватом вируса и образованием эндосомы с последующим слиянием оболочек вируса и вакуоли;
Ø слияние ЦПМ клетки и оболочки вируса (только сложноустроенные вирусы);
Ø впрыскиванием нуклеиновой кислоты (бактериофаги).
3. Раздевание (депротеинизация) вириона – освобождение нуклеиновой кислоты вируса, начинается сразу же после прикрепления вируса к рецептору клетки и продолжается в эндосоме, а также в цитоплазме клетки.
4. Эклипс-фаза (фаза затемнения) – репликация нуклеиновой кислоты и синтез вирусных белков, протекает в три стадии:
Ø синтез «ранних» белков – ферментов репликации;
Ø транскрипция, трансляция и репликация нуклеиновой кислоты;
Ø синтез «поздних» белков (капсидных).
Репликация нуклеиновой кислоты, как правило, происходит в ядре, а синтез белков – на рибосомах в цитоплазме, поэтому репродукцию вирусов называют дизъюнктивной/разобщенной.
5. Сборка вириона – вирусные белки и нуклеиновая кислота узнают друг друга и самопроизвольно соединяются, происходит сборка нуклеокапсида на мембранах эндоплазматической сети и аппарате Гольджи.
6. Выход вируса из клетки следующими путями:
Ø лизиса (взрыва) клетки (простоустроенные вирусы);
Ø почкованием (экзоцитозом) с захватом части ЦПМ, из которой образуется суперкапсид сложноорганизованных вирусов;
Ø просачиванием через поры ЦПМ клетки без ее гибели (только очень мелкие вирусы).
Наряду с полноценными вирионами в процессе репродукции формируются необычные по структуре и функции вирусные частицы:
Псевдовирионы – это вирионы, содержащие помимо собственной нуклеиновой кислоты и фрагменты нуклеиновой кислоты клетки-хозяина/другого вируса.
Вирусы-мутанты – это вирионы, по структуре и фенотипу отличающиеся от родительского (дикого штамма), но имеющие его генетическую основу. Известно 4 класса вирусов-мутантов:
Ø вирусы с условно-дефектными геномами – имеют мутантные геномы, дефектные при определенных условиях (изменение температуры, смена хозяина и др.);
Ø дефектные интерферирующие частицы (ДИ-частицы) – вирионы, у которых отсутствует часть геномной РНК/ДНК, но сохранены структурные белки;
Ø интеграционные вирусы с дефектным геномом – мутантные вирионы, геномы которых встроены в хромосому клетки-хозяина, потерявшие способность превращаться в полноценный вирус.
Вирусные частицы, или вирионы являются инертными, статическими формами вируса. Когда вирионы находятся вне клетки, они не репродуцируются. В настоящее время известно три типа взаимодействия вирусов с клетками хозяина.
Продуктивный тип взаимодействия заканчивается образованием вирусного потомства.
Абортивный тип не завершается образованием вирусных частиц, поскольку инфекционный процесс прерывается и не сопровождается формированием инфекционного потомства.
Интегративный тип взаимодействия вирусов с клеткой характерен для онкогенных вирусов, нуклеиновая кислота которых способна встраиваться (интегрироваться) в клеточную хромосому, вызывая трансформацию клеток. Границы между вирусами с автономной репликацией геномов и интеграционными вирусами довольно условны, и один и тот же вирус, в зависимости от вида клеток, может вести себя либо как инфекционный, либо как интеграционный геном. Результатом такого взаимодействия вируса и клетки является изменение наследственных свойств клетки. Данный тип взаимодействия вируса и клетки называют вироге-
нией, подобно лизогении при взаимодействии фагов с бактериями. Вирусы, способные вызывать вирогению, относят к группе умеренных.
Продуктивный тип взаимодействия вируса и клетки получил название репродукции вирусов (от англ. rерroduсе - воспроизводить). Репродукция вирусов - это образование по принципу комплементарности и путем репликации копий вирусных нуклеиновых кислот и индуцирование молекулами последних биосинтеза вирусных белков с последующей самоорганизацией этих компонентов в вирусные частицы.
Синтез и репликацию нуклеиновых кислот вирусов осуществляют ферменты. Используя нуклеотиды клетки, ферменты создают из них полинуклеотидные цепи новых молекул нуклеиновых. кислот вирусов. В зависимости от типа синтезируемых нуклеиновых кислот они называются ДНК-полимеразами или РНК-синтетазами. В некоторых случаях нуклеиновые кислоты вирусов реплицируются клеточными полимеразами - ферментами, присутствующими в клетке до ее заражения вирусом, хотя чаще репликацию вирусных нуклеиновых кислот осуществляют полимеразы, появляющиеся после заражения клетки вирусом. Такие полимеразы называют вирусспецифическими, так как биосинтез их закодирован в структуре нуклеиновых кислот самих вирусов. И, наконец, репликация нуклеиновых кислот некоторых вирусов происходит за счет предсуществующих в вирионе полимераз. Синтез вирусспецифических полимераз и вирусных структурных белков осуществляется на рибосомах клетки. Вирусные полимеразы, например РНК-репликазы, являются строго специфичными.
При большом разнообразии механизмов репродукции вирусов общим для них является то, что источником мономеров для синтеза и репликации нуклеиновых кислот служат нуклеотиды клетки. Источником мономеров для синтеза и построения белков всех вирусов являются аминокислоты, и синтез белков всех вирусов независимо от ультраструктуры их нуклеиновых кислот осуществляется в клеточных рибосомах. Источником энергии для биосинтетических процессов при репродукции вирусов является АТФ, которая вырабатывается в митохондриях клетки-хозяина.
Процесс репродукции вирусов включает шесть этапов: адсорбцию вируса на клетке; проникновение в клетку; депротеинизацию и освобождение вирусного генома; синтез вирусных компонентов в клетке-хозяине; сборку и формирование вирусов; выход зрелых вирусов из клетки.
Адсорбция, то есть прикрепление ви руса к клетке, осуществляется специфическими и неспецифическими механизмами. Неспецифический - определяется силами электростатического
взаимодействия. В этом процессе участвуют положительно заряженные аминные группы вирусного белка и кислые фосфатные группы клеточной поверхности, имеющие отрицательный заряд. Специфический механизм взаимодействия вируса и клетки обусловлен комплементарными клеточными и вирусными рецепторами. Вирусные рецепторы подразделяют на липопротеиновые (у арбовирусов) и мукопротеиновые (у миксовирусов и аденовирусов). Спектр чувствительности клеток к вирусам часто определяется наличием соответствующих рецепторов.
Резистентность клеток можно преодолеть путем разрушения клеточной мембраны, для чего используют инактивированный вирус Сендай. Специфические противовирусные антитела и антитела к нормальным клеткам препятствуют адсорбции вирусов. Процесс адсорбции состоит из двух периодов - обратимого и необратимого. Период обратимой адсорбции может закончиться десорбцией вируса. При длительном контакте клеток и вируса наступает стадия необратимой адсорбции. Адсорбированные вирионы таким образом могут частично элюироваться с поверхности клеток, небольшая часть остается интактной, а основная масса вирусных частиц проникает в клетку.
Проникновение вирусов в клетку осуществляется путем ви-ропексиса, или пиноцитоза. При этом в месте адсорбции вириона происходит сначала инвагинация наружной мембраны клетки и образование внутриклеточной вакуоли с вирусной частицей. Через некоторое время вирусная и клеточная мембраны вакуоли лизируются и высвобождается нуклеокапсид вируса. Другие вирусы, например вирус Неrреs simр1ех, проникают в клетку не путем виропексиса, а расплавления мембран вируса и клетки. После расплавления вирусный нуклеопротеид оказывается в цитоплазме. Большинство вирусов проникают в клетку путем виропексиса, меньшинство видов - путем сплавления. У фагов этот процесс, то есть освобождение ДНК и ее последующая инъекция сквозь оболочку бактериальной клетки, происходит непосредственно на поверхности этой клетки сразу же после прикрепления к ней фага.
Депротеинизация, или «раздевание» происходит постепенно в несколько этапов. Процесс освобождения вирусной нуклеиновой кислоты идет при активном участии самого вируса, индуцирующего образование в клетке ферментов и активаторов ферментов, необходимых для депротеинизации вирусной нуклеиновой кислоты. В процессе депротеинизации вирусов могут участвовать ферменты клеточных лизосом. Таким образом, депротеинизация завершается освобождением вирусного генома.
Как только вирусный геном освобождается от белка, вирусная нуклеиновая кислота дезорганизует работу клеточных систем. Вирус стимулирует синтез ингибитора клеточных РНК. Ингиби-
тор представляет собой белок - гистон, кроме того блокирующий процесс синтеза клеточной ДНК. Второй «ранний» вирусный белок препятствует осуществлению функции клеточной и-РНК. Термин «ранние» обозначает молекулы, синтезированные до репликации ДНК.
Реализация генетической информации вирусов осуществляется в соответствии с процессами транскрипции - синтеза информационных РНК, комплементарных матричным ДНК или РНК; трансляции - синтеза белков на рибосомах клетки с участием и-РНК; репликации - синтеза молекул нуклеиновой кислоты, гомологичных геному (рис. 7).
| Синтез вирусных ДНК у ДНК-содержащих вирусов осуществляется с помощью ДНК-полимераз. Благодаря участию этого фермента из нуклеотидов клетки синтезируется и строится вторая комплементарная нить ДНК, в результате чего образуются новые двухцепочечные молекулы ДНК. Процесс репликации молекул ДНК продолжается до тех пор, пока в клетке не накопится определенное их количество, необходимое для потомства вирусной частицы, проникшей в клетку.
Поскольку типы и формы нуклеиновых кислот разнообразны - кроме двухцепочечной ДНК могут быть РНК, одно- и двухцепочечные, линейные и кольцевые молекулы - то и механизмы их репликации различны.
У вирусов, содержащих двунитевуюРНК, синтез вирусных компонентов происходит сходным образом. «Ранняя» транскрипция у них осуществляется благодаря вирионному ферменту - РНК-зависимой РНК-полимеразе. Вирусы с однонитевой РНК по характеру синтеза белков разделяются на две группы: вирусы,
